引用本文
宋敏, 杨群慧, 王华, 季福武, 王虎, 潘安阳, 周怀阳. .完整极性脂质化合物对海洋微生物活动的指示及应用局限性. 地球科学进展, 2015, 30(10): 1162-1171
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完整极性脂质化合物对海洋微生物活动的指示及应用局限性
宋敏1,2, 杨群慧2,*, 王华1, 季福武2, 王虎2, 潘安阳2, 周怀阳2
1.同济大学环境科学与工程学院,上海 200092
2.同济大学海洋地质国家重点实验室,上海 200092
*通讯作者:杨群慧(1969-),女,湖南衡阳人,副教授,主要从事海洋生物地球化学研究. E-mail:yangqh@tongji.edu.cn

摇作者简介:宋敏(1989-),女,贵州金沙人,硕士研究生,主要从事海洋生物地球化学研究. E-mail:11_songmin@tongji.edu.cn

基金:国家重点基础研究发展计划项目“西南印度洋洋中脊热液成矿过程与硫化物矿区预测”(编号:2012CB417300); 中国大洋协会国际海底区域项目“西南印度洋多金属硫化物合同区环境基线综合集成研究”(编号:DY125-11-E-05)资助
摘要

回顾了近10年来完整极性脂质化合物（IPLs）在海洋微生物研究中的应用及存在的问题,并展望了IPLs应用的发展前景。作为新的热点之一,对海洋水体悬浮颗粒物中IPLs的研究,不仅推进了人们对水柱中IPLs分布和转化的了解,同时也深化了对古环境指标TEX86适用性的认识,有助于更好地开展古环境重建研究。色谱和质谱技术的发展,新型化合物的发现以及IPLs单体碳同位素分析的应用,使得IPLs在示踪海洋环境中真核生物与微生物共生作用、微生物介导的好氧和厌氧氨氧化以及甲烷厌氧氧化作用、微生物的代谢状态等方面也取得了重要研究进展。需要注意的是,由于不同的IPLs降解速率并不一致,其中部分古菌糖脂的降解周期可能远大于微生物群落的更新周期,因此可能并不适于表征活体生物量;同时,环境中氧气含量及有机质浓度也会对IPLs的降解速率造成影响;另外,在微生物不同的生长阶段,或者微生物由于生长环境条件变化产生生理响应时,IPLs组成也可能会发生变化。因此,应用IPLs指示微生物活动和反演古环境时应注意指标的适用性。

关键词: 完整极性脂质; 微生物活动; 悬浮颗粒物; 海洋沉积物; 局限性
中图分类号:P735 文献标志码:A 文章编号:1001-8166(2015)10-1162-10
Applications of Intact Polar Lipids for Tracing the Marine Microbial Activity and Their Limitations
Song Min1,2, Yang Qunhui2,*, Wang Hua1, Ji Fuwu2, Wang Hu2, Pan Anyang2, Zhou Huaiyang2
1. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China
2. State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, Shanghai 200092, China
Abstract

Intact Polar Lipids (IPLs) are synthesized predominately or uniquely by specific organisms and would degrade rapidly after cell death. Such biomarker IPLs can be used to indicate the microbial distribution and activity in marine environment. Here the progress of the aforementioned studies made over the last decade was reviewed. With the development of chromatography and mass spectrometry, the discovery of new IPLs compounds and the application of stable carbon isotope composition ( δ13C) of IPLs, our understanding of the composition and transformation of IPLs in suspended particulate matter in the water column and of the applicability of the TEX86 proxy are greatly improved. Besides, IPLs are widely applied in the study of marine eukaryotes-bacteria symbiosis, aerobic and anaerobic ammonia oxidation, anaerobic methane oxidation and microbial metabolic states. Meanwhile, it is suggested by recent studies that different IPLs often exhibit differential degradation. Some IPLs, especially glycolipids, have the potential to be preserved as fossil molecules for very long time upon dead cells, and therefore, they can not specifically indicate living biomass. Furthermore, the IPLs degradation rate and completeness would be affected by such factors as oxygen concentration and organic matter content. It is also suggested that the composition of IPLs might be affected by microbial metabolism. Therefore, it is essential to take these factors into account when IPLs are used as proxies to trace marine microbial activities and reconstruct the palaeoenvironment.

Keyword: Intact polar lipids; Microbial activities; Suspended particulate matter; Marine sediment; Application limitations.

微生物是地球上数量最为丰富的有机体, 在全球碳、氮、硫等生物地球化学循环过程中扮演着十分重要的角色[1, 2]。海洋中栖息着数量众多的微生物, 其分布范围可从水柱延伸至海底以下几千米的深度[3], 大洋钻探计划的推行极大地推进了人们对海洋深部生物圈的研究, 使得对深海微生物的分布、丰度、以及它们参与的生物地球化学活动开始有所了解[4]。

研究微生物的方法可分为培养法和非培养法。深海环境的特殊性使得培养法很受限制, 据报道只有大约0.001%~0.1%的深海微生物能够成功培育[5]。非培养法主要有基因法和脂质生物标志化合物法。基因法如16S rRNA依赖于对DNA或RNA的有效提取, 通过多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增或者基因探针杂交来定量, 但是引物和探针的选择可能会选择性地掩蔽古菌域的信息[6, 7]。脂质生物标志化合物由于既能指示当代有机体, 又能作为分子化石追踪古环境下的生物源, 而得到广泛的应用。

完整极性脂质(Intact Polar Lipids, IPLs)是细胞膜的重要组成成分, 细菌、古菌和真核生物生命三域均具有各自特征的完整极性脂质结构[8]。细菌和真核生物的IPLs结构比较相似, 一般在甘油骨架的sn-1和sn-2位上以酯键连接两条脂肪酰基侧链, 在sn-3位置上连接头基团, 一般为磷酸基[9], 形成典型的双分子层结构。此外, 细菌还具有非类异戊二烯四醚的单层跨膜结构[10]。与细菌和真核生物不同, 古菌IPLs的特征结构是, 在甘油骨架的sn-2和sn-3位上通过醚键连接两条类异戊二烯侧链, 在sn-1位置连接头基团, 一般为糖头基、磷头基或者磷糖头基[11], 构成二醚或者四醚化合物, 对应的古菌细胞膜具有双层（二醚类脂质）和单层跨膜（四醚类脂质）两种结构[12]。

不同微生物的IPLs从核脂的链长、不饱和度、环数等, 到极性头基团的结构都是多种多样的[12], 造成这种多样性的原因主要有两方面, 一方面是由于不同的微生物种群会选择性地合成各自的特征脂类化合物, 另一方面由于环境条件的影响, 微生物会合成对自身有利的脂质以更好地适应环境条件的变化。微生物死亡后, IPLs的头基团可迅速被酶解而转化成更为稳定的非极性核心脂结构[13]。由于这一特性, IPLs被用于指示活体生物量和生物活动, 尤其是在深海生物圈等难以进行原位研究的系统。与之相反, IPLs头基脱落后剩下的核心脂成分化学性质比较稳定, 能够在漫长的地质时间内（有时到上百万年）以“ 分子化石” 的形式保存下来, 因此常常被用于古环境的重建, Pearson[14]与Schouten[15]等人近年来对甘油二烷基甘油四醚（GDGT）分子指标的应用做了详尽的综述。

目前, 国内关于IPLs的研究还处于起步阶段。在2010年, 姚鹏等[16]对IPLs在指示海洋沉积物中现存微生物方面的应用进行了综述。本文根据近几年来IPLs的最新研究结果, 介绍了IPLs在海洋水体悬浮颗粒物中的最新研究进展, 阐述了IPLs对海洋微生物活动的指示作用, 包括示踪真核生物与微生物的共生作用、好氧及厌氧氨氧化作用、甲烷厌氧氧化作用, 以及指示微生物的代谢状态等, 最后, 探讨了IPLs在指示现存微生物应用方面存在的局限性。期望通过这些最新研究成果的综合评述, 进一步推进国内IPLs的研究。

1.海洋水体悬浮颗粒物中IPLs的分布及指示意义

海洋水体悬浮颗粒物中IPLs的研究在近几年来取得重要进展, 海洋水体不同深度悬浮颗粒物中IPLs及其核心脂化合物的组成及丰度各不相同, 为研究海水水柱中微生物群落的分布及生物量提供了重要依据[17, 18]。当前研究主要聚焦于海洋水体悬浮颗粒物中IPLs的分布, 通过分析IPLs的来源及去向, 探讨TEX86古环境分子指标的适用性。

Schouten等[19]根据GDGTs化合物上环戊烷基团数量随温度变化的特征, 引入了TEX86指标来指示GDGTs环戊烷基团的相对丰度。由于表层沉积物核心脂GDGT-TEX86往往与年平均表层海水温度或上层水柱集成温度值相关, 而被广泛用于反演古海水表层温度(surface sea temperature, SST)[20]。该指标适用性的一个重要前提是, 海洋表层水体中合成的GDGTs能有效运输至海洋表层沉积物中[21]。对海洋水体悬浮颗粒物中IPL GDGTs及其核心脂GDGTs分布情况的研究将有助于对这一过程的认识。

Schouten等[22]在Arabian Sea水柱的研究中发现, 表层海水核心脂-TEX86值与原位温度具有较好相关性, 而深部海水中核心脂和IPL GDGTs计算的TEX86值往往并不反映原位海水温度, 并且IPL GDGTs计算的TEX86值往往大于核心脂的计算值, 他们认为, 带不同头基团IPLs的选择性降解是造成这一偏差的原因。奇古菌培育菌株研究发现, GDGT-1核心脂主要与糖磷糖头基团(HPH-)连接, 而GDGT-2, -3和-4核心脂主要与二糖头基团(DH-)连接[23, 24]。由于HPH-GDGTs的降解速率相对仅携带糖头基团的GDGTs要高, 相对较多的GDGT-1将从IPLs池中转移至核心脂池中, 从而造成IPL GDGTs-TEX86值大于核心脂GDGTs-TEX86值[9, 22]。

Xie等[18]对东热带北太平洋低氧区水柱颗粒物的研究同样发现, IPL GDGTs计算的TEX86值大于核心脂GDGTs的计算值, 但是带有相对高温信号的糖头基GDGTs的优先保存并不能合理解释这一现象。研究发现, 与核心脂GDGTs计算值相比, MH-GDGTs往往具有较冷的TEX86温度估算值, DH-GDGTs则相反[25], 由于MH-GDGTs和DH-GDGTs这2种化合物在悬浮颗粒物中丰度较高, 均为海洋奇古菌来源, 且化学稳定性相似, 无法解释IPL GDGTs池总体具有较高温的TEX86温度估算值这一现象, 需要进一步从水柱和沉积物中原位合成的IPL GDGTs的降解周期以及不同化合物的差异性降解等方面深入研究对沉积TEX86信号的影响[18]。在低氧区, 原位可合成大量GDGTs, 这些化合物极有可能被运输至海底表层沉积物中, 使得沉积物中GDGTs计算的TEX86与SST相关性减弱。因此在具有低氧区的海域, 利用表层沉积物中GDGT-TEX86指标来估算SST时尤需谨慎。

Basse等[26]对西北非Cape Blanc水柱真光层、最小含氧带和中间雾状层颗粒物IPLGDGTs的进一步研究中发现, 来自具有高生产力表层水区域下方沉积物的TEX86指标能够有效反演长期平均表层海水温度。在最小含氧带和中间雾状层中运用IPLs和核心脂计算的TEX86值明显较其他层位要高, 造成这一现象的原因既非陆架区颗粒物的侧向输送, 也不是化合物的选择性降解, 而是由于原位产生的古菌输入造成, 低氧和高硝酸盐含量的生境氨氧化古菌丰度增加, 输入高含量的crenarchaeol isomer, 导致计算的TEX86值升高。而深层水体及海底表层沉积物中基于核心脂计算的TEX86值与真光层计算的核心脂TEX86值具有较好的相关性, 并没有受到最小含氧带和中间雾状层高TEX86值的影响, 可能是由于在低氧区/中间雾状层中缺乏有利于沉降的结合了GDGTs的聚集体或粪团粒; 另外, 在最小含氧带和中间雾状层以下深度, 原位古菌的产生显著减少, 颗粒物主要来自表层海水的沉降死体。

总的来说, 目前为止, 对于海水水柱悬浮颗粒物中的IPLs的分布、来源和去向的研究仍处于起步阶段, 随着对这一方向研究的深入, 必将促进对海洋水柱中微生物群落分布以及对古温度指标TEX86适用性的认识。

2. IPLs对海洋微生物活动的指示作用

IPLs对微生物活动的指示作用是其重要的应用之一, 结合稳定碳同位素及微生物学等手段, 可对海洋微生物参与的生物地球化学活动进行示踪, 例如, 真核生物与微生物的共生作用、海洋水体及沉积物中的好氧/厌氧氨氧化反应和甲烷厌氧氧化反应, 同时, IPLs还可作为示踪海洋微生物代谢状态的有效工具。

2.1示踪真核生物与微生物的共生作用

在海洋环境中无论是正常海域还是极端海底环境下, 真核生物与微生物的共生作用都普遍存在, 比如在海水及海洋表层沉积物中硅藻与蓝细菌的共生作用, 以及冷泉和热液极端海底环境下贻贝、管状蠕虫等真核生物与嗜甲烷或嗜硫细菌之间的共生作用。IPLs类脂生物标志物在示踪这些共生作用以及分析宿主与共生体之间的相互关系中发挥了重要作用。

蓝细菌是广泛存在的一种产氧光合菌, 在全球碳氮循环中发挥着重要作用。其中丝状蓝细菌具有具有一种特殊的异形胞, 是进行固氮作用的场所。这种异形胞蓝细菌在湖泊、港湾等水体环境中以游离态形式存在, 但在远洋环境中很少发现游离态的异形胞蓝细菌, 而主要以内共生形式寄生在海洋硅藻上[27]。游离态的异形胞蓝细菌往往合成一系列独特的糖脂化合物, 这种异形胞糖脂化合物往往由C6糖头基团(以葡萄糖为主, 少数情况下有半乳糖或甘露糖)连接在长链二醇、三醇或者羟基烯酮核心脂上, 链长为C26~C30[28]。而以内共生形式存在于海洋硅藻上的异形胞蓝细菌具有不同于游离态异形胞蓝细菌的糖脂结构, 研究发现在海洋硅藻上内共生的异形胞蓝细菌Hemiaulus-Richelia能够合成特殊的带戊糖头基团(C5heterocyst glycolipids, C5 HGs)的糖脂, 而非C6 HGs, 核心脂结构包括C30-C32三醇和四醇。研究认为, C5HGs的合成可能是内共生蓝细菌为适应宿主硅藻体内的高氧量而作出的调整, 因此C5 HGs具有指示海洋内共生异形胞蓝细菌的潜力[29]。Bale等[30]分别对海洋和淡水环境的水体悬浮颗粒物和表层沉积物进行IPLs成分分析, 发现栖息着共生硅藻的海洋中检测到明显的C5 HGs, 与之相反, 淡水环境中仅检测到C6 HGs, 验证了C5 HGs具有指示海洋内共生异形胞蓝细菌的潜力。

除了正常海域, 在海底极端环境下也广泛存在着真核生物与微生物的共生现象, 1981年科学家在太平洋热液区的巨型管虫体内首次检测到嗜硫化物的内共生菌[31], 从此深海共生菌的存在及作用便成为广泛研究的热点。至今为止, 还未实现深海共生细菌的分离和纯种培养, 可能是由于化能合成共生菌的原位生长条件很难重建, 或者内共生菌简化的基因组使其无法在宿主体外存活[32]。研究者们主要通过分子生物学等间接手段研究深海内共生菌的生理功能及生态作用等, 近年来, IPLs及其稳定碳同位素分析开始应用于示踪这种特殊的共生作用, 并进一步揭示了宿主及共生微生物之间的营养关系。Kellermann等[33]对采自冷泉及热液区寄生着不同类型共生菌的贻贝进行IPLs及单体碳同位素分析, 在寄生有共生菌的贻贝鳃组织内检测到带PG、PE、二磷脂酰甘油(Diphosphatidylglycerol, DPGs)头基和C16:1脂肪酰基链的IPLs, 与前人发现的嗜甲烷菌和嗜硫菌的特征IPLs结构相似, 而在没有寄生菌的足部组织中没有检测到以上化合物。进一步通过IPLs的单体碳同位素分析, 发现嗜甲烷菌往往具有更负的δ 13C值, 共生菌与宿主的类脂组分具有非常相似的δ 13C值, 指示宿主组织极有可能直接通过共生菌获取碳源。

2.2示踪氨氧化作用

好氧氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing Archaea, AOA)与厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidizing, Anammox)细菌分别在海洋好氧氨氧化与厌氧氨氧化活动中占据主导地位, 在全球氮循环中发挥重要作用[34]。其中海洋AOA隶属于新近从古菌域中分离出来奇古菌门Thaumarchaeota[35], Anammox细菌属于浮霉菌门, 是无机化能营养型微生物[36]。

两类微生物均能够合成特异性的类脂生物标志化合物, 其中AOA能够特异合成crenarchaeol, 该化合物是具有一个环己烷基团以及4个环戊烷基团的GDGT化合物, 被认为是AOA古菌的特征生物标志物[24, 37]。对海洋沉积物中新近培育成功的AOA菌株进行分析, 发现AOA合成的IPLs化合物主要携带MH-、DH-、PH-以及HPH-头基团, 其中, HPH-crenarchaeol是唯一存在于所有AOA菌株中的化合物, 且化学性质相较其余化合物更不稳定, 因此被认为是最适于示踪活体AOA的生物标志物[24]。在海洋水柱研究中发现, 在低氧区HPH-crenarchaeol与以AOA居多的奇古菌的基因丰度和表达相符, 证实自然环境中该化合物对AOA的指示作用[38, 39]。

Anammox细菌一般以梯形烷脂质为其特征生物标志物[40]。其核心脂化合物有C18-[3](/[5])-梯烷脂肪酸、C20-[3](/[5])-梯烷脂肪酸, 以及C20-[3]-梯烷单醚等结构。相对核心脂来说, 完整极性梯烷脂质结构更为丰富多样, 在甘油基的sn-1位上连接着包括直链和甲基化的脂肪酸、梯烷结构等多种疏水尾链结构, 而sn-3位上则连接磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylcholine, PE)或者磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)等头基团[41, 42]。在海洋沉积物研究中发现, 完整极性梯烷脂C20-[3]-ladderane monoalkylether-PC具有准确反应环境中的原位anammox活动及生物量的潜力[43, 44]。

实验室模拟实验指示, 好氧氨氧化反应在消耗氧气的同时可为anammox细菌提供亚硝酸盐, 促成两类微生物之间的合作关系, 而另一方面, 如果anammox细菌具有其他的亚硝酸盐来源, 便与AOA形成竞争铵盐的关系[45]。在海洋环境中, AOA古菌与anammox细菌的空间分布以及两者的相互关系成为广泛探讨的科学问题之一。Pitcher等[39]在Arabian Sea 低氧区发现AOA特征生标HPH-crenarchaeol在氧气含量约为5 µ mol/L的OMZ上层丰度最高, 与thaumarchaeotal 16S rDNA和amoA基因丰度峰值及基因表达相对应, 而anammox 细菌的特征生标PC-C20-[3]-单醚梯形烷脂质在氧含量最低的OMZ核心区取得峰值, 与anammox 16S rDNA和hydrazine oxidoreductase (hzo)基因丰度峰值和基因表达对应。由于研究区AOA古菌及anammox 细菌的垂向分布距离较远(> 400 m), 两类氨氧化微生物可能并不存在合作或竞争关系。而Sollai等[34]利用特征生标HPH-crenarchaeol和PC-单醚梯形烷脂来分别指示AOA古菌与anammox细菌在东热带北太平洋水柱中的分布, 发现两者在沿岸水体中具有明显的生境分离现象, 而在远洋水体中两者的生境部分重合, 可能存在合作或竞争关系。

2.3示踪甲烷厌氧氧化作用

自然环境中大多数甲烷都是由产甲烷菌产生的[46], 而海洋沉积物中产生的甲烷绝大多数被甲烷厌氧氧化反应(Anaerobic Oxidation of Methane, AOM)所消耗, AOM被认为是海洋环境中最重要的甲烷汇过程[47, 48]。AOM反应往往发生在深部沉积物的硫酸盐-甲烷转换带(sulfate-methane transition zone, SMTZ), 在具有较高的甲烷通量的海底冷泉及热液环境中, AOM反应更为明显和强烈。AOM反应主要由硫酸盐还原细菌(sulfate reduction bacteria, SRB)和厌氧嗜甲烷古菌(ANaerobic MEthanotrophic archaea, ANME) 的互养共生体所介导[49, 50]。

海洋环境中的AOM反应最初通过类脂生物标志化合物及其单体碳同位素分析得到验证[51], 研究者们在甲烷渗漏区沉积物中检测到来自古菌的类脂化合物古菌醇(Archaeol, AR)和羟基古菌醇(OH-AR), 两者均具有非常强烈的（-100‰ 及以上）13C亏损, 较甲烷13C亏损40%~50%, 指示其嗜甲烷古菌的生物来源。根据亲缘关系的差异, 目前已知的厌氧嗜甲烷古菌被归类到3个类群, 即ANME-1, ANME-2和ANME-3[47]。Rossel等[52, 53]报道了3类主要ANME古菌及共生SRB细菌的特征IPLs组成：ANME-1主要合成二糖基GDGT, ANME-2及ANME-3主要合成带磷酸盐头基的古菌醇和羟基古菌醇, SRB细菌的特征IPLs往往带PE或者磷脂酰二甲基乙醇胺(phosphatidyl-(N, N)-dimethylethanolamine, PDME)头基团, 其中与ANME-1共生的菌落主要合成二烷基甘油二醚, 而与ANME-2和ANME-3共生的菌落则往往合成甘油酰基/醚混合的衍生物。

通过IPLs分析, 还可区分ANME群落在不同环境条件下的分布。比如, 研究发现, ANME-1特征生标IPL GDGT-1, -2, -3在深部沉积物中硫酸盐含量较低的层位含量增加, 而ANME-2特征生标IPL-OH-ARs在细菌IPLs含量最高的浅部沉积物占据主导地位, 指示具有高丰度的ANME-2/SRB群落以及强烈的AOM及硫酸盐还原反应[54]。

近年来, IPLs及其单体碳同位素组分分析成为研究自然环境中微生物群落复杂的碳代谢作用的有力工具。对于与AOM反应相关的微生物来说, 由于吸收利用了13C亏损的甲烷碳或甲烷的反应产物, 其IPLs化合物往往具有强烈的13C亏损。比如, 在墨西哥湾南部沥青冷泉区, 微生物在富含石油的沉积物中勃发, Schubotz等[49]通过对带有不同极性头基团的IPLs的烷基和酰基组分进行稳定碳同位素分析, 识别其中复杂的微生物群落分布。研究显示, 异养型与自养型细菌来源的IPLs携带不同的头基团, 其中携带PE、PG、DPG头基团, 以支链和奇碳数脂肪酸或者酰基甘油醚为核心脂的IPLs, 具有相对CO2偏负的稳定碳同位素值（△ δ 13C=-8~-15‰ ）, 主要来自自养型SRB, 部分参与了AOM反应; 携带PME、PDME头基团, 以饱和、单不饱和C16和C18脂肪酸为核心脂的IPLs主要来自异养型石油降解细菌, 其稳定碳同位素值相对与TOC更为相近。嗜甲烷古菌与产甲烷古菌来源的IPLs具有不同的头基团, 携带磷头基团的羟基古菌醇（P-OH-ARs）具有相对甲烷明显亏损的δ 13C值（△ δ 13C达到-40~-42‰ ）, 主要来自ANME-2古菌; 而携带PG和PE头基的古菌醇（P-ARs）, 其δ 13C值相对甲烷偏正, 但相对CO2亏损（△ δ 13C 达到-33~-50‰ ）, 指示其具有产甲烷古菌来源; DH-GDGTs的δ 13C值介于P-ARs和P-OH-ARs之间, 可能同时具有嗜甲烷和产甲烷古菌来源, 而P-GDGTs和PH-GDGTs具有与P-ARs相似的δ 13C范围, 指示其产甲烷古菌来源。

在具有AOM反应的冷泉环境中, 除了ANME古菌和SRB细菌以外, 科学家发现还有多种底栖古菌存在的信号, 比如Miscellaneous Crenarchaeotal Group (MCG)、Marine Benthic Group D (MBG-D)、Marine Benthic Group B (MBG-B)、Deep-sea Hydrothermal Vent Euryarchaeota group 8 (DHVE-8), 这些尚未实现分离培养的底栖古菌在甲烷冷泉环境的碳循环中起到了何种作用, 目前了解甚少。Yoshinaga等[54]通过IPLs及其单体碳同位素分析结合分子生物学手段表明, 未培养的异养型底栖古菌在甲烷冷泉的碳循环中发挥着重要作用。MCG、MBG-B、MBG-D等异养型底栖古菌, 可能是造成甲烷冷泉沉积物中PG-GDGTs往往具有相对IPL-OH-ARs和IPL-ARs富集13C[49]的原因。异养型古菌的碳同化作用可产生非常不均一的不饱和GDGTs碳同位素信号, 具有明显13C亏损的带半乳糖头基团的不饱和GDGTs(G-Uns-GDGTs)可能来自MBG-D或DHVE-8, 它们由于利用了与AOM相关的生物质发酵降解的代谢产物, 从而导致其IPLs具有明显的13C亏损。由于目前缺乏可合成不饱和GDGTs化合物的培育菌株的数据, 尚不能完全排除不饱和GDGTs也可来自自养型生物的可能性, 有待于后期进一步深入研究。

2.4示踪微生物的代谢状态

作为微生物细胞膜的重要组成成分, IPLs的分析还有助于揭示微生物的代谢状态, 目前对这方面的研究主要集中于纯培养的微生物, 比如, Elling 等[55]对首个实现纯培养的海洋AOA 菌株Nitrosopumilus maritimusas进行研究, 结果显示AOA古菌在不同的生长阶段其类脂组分变化显著, 其中MH-GDGTs在总IPLs中的相对含量从生长期早期至稳定期末期有上升的趋势, 而长期以来作为活体AOA生物量指标的HPH-GDGTs与之相反, 在生长期的相对含量比稳定期大七倍左右, 很好地指示了AOA代谢活跃的生长期。相应地MH-GDGT/HPH-GDGT比值可指示细胞的不同生长阶段, 比值高指示稳定期, 反之则指示生长期。DH-GDGT和DH-OH-GDGT在细胞的整个生长阶段变化不大, 相对HPH-GDGT来说, 这2种化合物更适于指示活体AOA的生物量。通过IPLs的分析, 还可揭示微生物对环境变化的响应, 比如, Meador等[56]研究超高嗜热古菌Thermococcus kodakarensis(KOD1)在磷营养供给变化时其IPLs组分的变化, 发现减少培养基中的有机质及磷酸盐供给时, 细胞显著变小, 而胞内IPLs的含量显著增加, 以包含多个P原子和糖头基的IPLs居多, 与浮游植物通过减少含磷IPLs成分来应对磷限制条件相反[57], 古菌通过增加含磷IPLs的合成来实现磷的储存。

IPLs对微生物生长代谢的示踪在深海深部生物圈的研究中尤其适用, 因为深部生物圈的微生物很难实现纯种培养, 而通过对微生物的特征IPLs生物标志物的非极性核心脂或极性头基团分别进行δ 13C分析, 有助于获知微生物的代谢信息, 比如, Takano等[58]将13C标记的葡萄糖添加到沉积物中检测原位古菌合成生物膜的机制, 结果显示13C在古菌生物膜脂质的甘油基团上出现, 而在核心脂上则没有检测到13C的信号, 从而指出部分海底深部古菌通过回收利用古菌核心脂化石分子来合成生物膜, 以最大化地降低自身合成所需能量。

3.IPLs表征现存微生物的局限性

表层以下1 m以深的深部沉积物中包含大量的活体微生物[59], 但以何种生命类型占主导, 一直是科学家关注的问题。Lipp等[6]利用IPLs法分析了日本纪伊半岛近海、加拿大和秘鲁近海、黑海等世界16个海域通过钻探获取的海底沉积物, 结果显示微生物IPLs丰度随深度降低, 在1 m以下深度沉积物中提取的IPLs, 有87%来自古菌, 指示深部沉积物以古菌占绝对的主导地位。这一报道使得IPLs作为“ 生命标志物” 的应用得到前所未有的广泛关注, 同时有关其应用的局限性也逐渐引起重视。

研究发现, 不同类型的IPLs降解情况并不一致, 尤其是磷脂和糖脂IPLs的降解速率体现了较大的差异, Schouten等[60]利用模型计算的方法指出, 糖脂比磷脂更能经受住降解作用的影响, 在深部沉积物中具有以化石形式保存下来的潜力, 因此相对磷脂来说较不适于指示活体微生物。后来对环境样品的研究也验证了这一说法, 比如, Logemann等[61]在北海缺氧砂质沉积物中进行了IPLs的降解实验, 发现在100天时间范围内, 古菌醚键IPLs明显比细菌酯键IPLs更为稳定。

Lipp等[62]认为, 尽管不同脂质可能降解情况各异, 但IPLs指示活体生物量的应用主要依赖于胞外IPLs的降解速率和降解完成度, 只要胞外IPLs的降解周期比微生物群落的更新周期快, 就不会影响IPLs对活体生物量的表征。为了探索古菌胞外IPLs与微生物群落周期之间的关系, Lin等[63]利用稳定碳同位素探针实验发现二糖基甘油二植烷甘油四醚(diglycosyl-glycerol dibiphytanyl glycerol tetraethers; 2G-GDGTs)的合成速率非常低, 更新周期长达1 700~20 500年, 比海底微生物群落的周期要长得多, 说明海底古菌生标2G-GDGTs并不仅仅源自活体古菌, 而更像是长期积累下来的化石分子。同样, Xie等[64]利用14C标记的糖基甘油二醚(([14C]glucosyl)-diphytanylglyceroldiether, GlcDGD)作为古菌IPLs的代表, 对陆缘沉积物进行为期300天的培养实验, 发现糖脂的降解速率比磷脂低1-2个数量级; 1 m以下深度沉积物中微生物群落的更新周期大概为1.6~73 ka, 而GlcDGD的半衰期随深度增至310 ka, 远远高于微生物群落的更新周期, 因此检测到的古菌IPLs绝大多数代表了化石信号, 并指出, Lipp等[6]利用IPLs估算的全球深部生物圈生物量可能偏高了, 深海生物圈并不一定是以古菌占主导。

IPLs的稳定性是影响其表征活体生物量的重要因素之一, 除此之外, 环境条件对IPLs降解速率的影响也不容忽视, 已有大量研究指示其核心脂成分受环境条件影响较大, 如温度和pH等, 但对于IPLs受环境因子影响的报道较少, 以Harvey等[65]的报道最为经典, 他们研究了海洋沉积物中氧气含量和有机质含量对细菌IPLs降解速率的影响, 发现在氧气含量较高的条件下IPLs降解速率较高, 在有机质浓度较高的条件下, IPLs降解速率较低, 可能的原因之一是, 在除脂类以外的有机质含量较高时, 沉积物中微生物对其他有机质的降解作用会抑制对脂类的降解。因此, 在应用IPLs指示活体微生物时需综合考虑各种因素的影响。

4.结语和展望

完整极性脂质化合物由于在细胞死亡后能够迅速降解而被用于示踪海洋环境中的微生物的分布及活动, 尤其在深部生物圈的应用很好地弥补了微生物学研究的不足, 因此日益受到关注。色谱和质谱分析技术的发展, 则有力地推进了IPLs生物标志化合物的研究进展。比如, Wö rmer等[66]基于亲水作用色谱(HILIC)和反相色谱 (RP)法, 对高压液相色谱电喷射离子化串联质谱(LC-ESI-MS2)方法进行改进, 显著改善了IPLs化合物的出峰分辨率和检测限, 实现了对超低含量环境样品类脂化合物的测试; Zhu等[25]使用改进的反相液相色谱— 电喷射离子化质谱联用(RP-ESI-MS）分析方法, 实现同时对醚脂化合物的头基团和核心脂质结构进行分析。

海洋水体悬浮颗粒物中IPLs的研究作为近几年新的研究热点之一, 不仅推进了人们对水柱中IPLs的分布和转化的了解, 同时也深化了对古环境指标TEX86适用性的认识, 有助于更好地开展古环境重建研究。新型化合物的发现以及IPLs单体碳同位素分析的应用, 使得IPLs在示踪海洋环境中真核生物与微生物共生作用、微生物的好氧及厌氧氨氧化作用、甲烷厌氧氧化作用以及微生物的代谢状态等方面取得了重要研究进展。

需要注意的是, IPLs在指示活体微生物时具有一定的局限性, 表现为不同的胞外IPLs降解速率并不一致, 其中古菌来源的醚键糖脂在环境中具有以化石分子形式长期保存下来的潜力, 尤其是在缺氧环境下, 部分糖脂的降解周期可能远大于微生物群落的更新周期, 因此可能并不适于表征活体生物量。自然环境中氧气含量及有机质浓度也是影响IPLs降解速率的重要因子, 表现为氧气含量越高, 有机质浓度越低, IPLs降解速率越快, 是否还有其他环境因子对IPLs的降解造成影响, 有待进一步的研究。

初步研究表明, 微生物在不同的生长阶段, IPLs组成会发生变化; 当生长环境条件变化时微生物会产生生理响应, 相应地其细胞膜脂类结构也可能发生变化。但是目前对于这一方面的研究还较少, 有待于进一步加强。另外, 目前发现的大多数IPLs化合物对生物源的分类特异性较低, 较难准确地指示环境微生物的分布及其活动, 因此, 通过纯培养等生物学手段寻找更多较高分类特异性的IPLs也应是将来的研究重点之一。

可以预见在不远的将来, 随着色谱和质谱分析技术和微生物分离培养技术的发展, 对海洋环境样品中IPLs的定性和定量及其微生物学指示意义的研究将更为准确。从海洋水柱到海底深部生物圈, IPLs在评估微生物群落分布和生物量、示踪微生物的生物地球化学活动, 以及重建古环境等方面必将发挥重要作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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