腐殖酸是环境中重要的活性组分,参与土壤、沉积物与水体许多物理、化学与生物反应,影响一些元素、外来有机污染物的环境行为和生物有效性。土壤酶或外源蛋白则影响着土体内各生物化学过程的速度和强度,其活性是土壤质量和健康的有效指标；同时,存在于地表或表层水体的一些病原蛋白(如杀虫蛋白毒素、转基因植物产生的药物蛋白、易传染蛋白等)具有潜在危害。尽管土壤矿物与酶的相互作用已比较明确^{[ 1]},但对腐殖酸与酶相互作用的机理等仍不清楚^{[ 2]}。腐殖酸与酶的相互作用将会改变酶的生物活性和稳定性,影响土壤生物化学过程和物质循环,从而影响土壤环境、地力质量及其土壤圈的生态过程；同时,理解它们的耦合作用机理还将推动土壤界面化学与生物化学的深入发展。

谭文峰教授承担的国家自然科学基金面上项目“土壤腐殖酸与酶相互作用机制及其对酶特性的影响(项目批准号：40971144)”,以湖北九宫山山地草甸土和吉林通化暗棕壤中的胡敏酸和富里酸为材料,以国际标准腐殖酸为对照,研究了腐殖酸与溶菌酶、脲酶、酸性磷酸酶相互作用的电荷变化、焓变、复合物形成特点,利用滴定微热量仪、电荷颗粒测定仪、动态光散射、圆二色谱等现代技术分析了腐殖酸与酶相互作用过程的微观机制与影响因素,探讨了腐殖酸对酶活性、稳定性、结构等的影响。项目实现了“土壤腐殖酸与酶的微观作用机制与宏观动态表现相结合,揭示不同类型腐殖酸对酶特性的影响,阐明它们相互作用的环境功能与生物地球化学循环特点”的研究目标。

经过3年的努力,该项目顺利结题并取得如下具体成果：

(1)发展了腐殖酸表面绝对电荷量的测定方法。采用阳离子聚合物滴定腐殖酸,根据在等电点(IEP)处复合物的质量比即可计算出腐殖酸表面在某一条件下的绝对电荷量,并将单点滴定扩展为多点滴定,使测定精度进一步提高,解决了土壤中难于获得软胶体物质绝对电荷量的测定难题^{[ 3]}。在此基础上构建了酸碱滴定体系,得到不同离子强度间的电荷变化差异,获得准确度较高的酸碱滴定曲线和电荷分布曲线^{[ 4, 5]}。

(2)当腐殖酸与溶菌酶相互作用时,所形成的复合物颗粒大小随正负电荷比例的增加呈峰形变化,在等电点时达到最大；超过等电点时,其颗粒尺寸逐渐减小、直至达到稳定值,这是一个部分可逆的反应过程；而随着离子强度的增加,复合物颗粒的大小会形成一个峰形的台阶^{[ 6]}。由于软胶体物质相互作用过程中不能固液分离增加了研究难度,该项目通过动态观测颗粒变化获得两者相互作用的过程,此类实验现象目前还未有报道,从而为研究软胶体物质的环境行为提供了新的思路。

(3)土壤腐殖酸与酶结合能力较强,主要以静电吸附和疏水作用为主,但在等电点时的相互作用力主要是疏水作用；两者的交互作用受热焓驱动,为放热反应；随着反应体系支持电解质浓度的增加,释放的热量逐渐减少,反离子的桥键作用增强、腐殖酸与酶的作用力减弱^{[ 7]}；支持电解质参与了腐殖酸—酶复合的电荷平衡,阳离子的陪补效应随离子强度的增加而增强,精确计算出不同条件下阳离子的贡献量^{[ 8]},从而将过去的定性描述发展为定量计算,也为二者在不同条件下的作用机理提供了直接证据。

(4)腐殖酸与酶相互作用对酶的活性与稳定性均有保护作用,腐殖酸的加入对酶二级结构中的α-螺旋和转角比例影响较大,而对α-螺旋和无规则卷曲影响较小；该保护作用和结构变化与腐殖酸表面疏水性、静电作用强度以及腐殖酸与酶间的包被程度有关。这些结果阐明了腐殖酸和蛋白质在生物地球化学循环中的作用与功能,为提高土壤肥力、调控污染物的环境行为提供了科学依据。

受该项目资助,申请者及研究团队在 Environmetal Science & Technology,Geochimica et Cosmochimixa Acta, Soil Science Society of America Journal, European Journal of Soil Science等本领域TOP期刊发表SCI论文6篇,均为第一标注。先后在第十二届中国青年土壤科学工作者学术研讨会(2010年)、全国土壤化学—土壤环境专业委员会学术研讨会(2012年)、第一届全国耕地质量提升研讨会(2012年)做大会或特邀报告,在第十六届国际腐殖质大会(2012年)和第七届国际界面与污染会议(2012年)做口头报告,并应邀在日本筑波大学、北海道大学、东京大学讲学,作为唯一的中国代表参与“土壤与水环境中胶体与界面”亚洲协作网的创建(2013年,筑波)。在该项目的支持下,培养了博士生2名、硕士生2名。上述部分结果被编入《10000个科学难题》^{[ 9]}；意大利土壤化学专家Rao M A在“ Soil Interfaces in a Changing World”综述文章中认为,这些结果“对理解土壤胶体表面蛋白质的行为有重要贡献”^{[ 10]}；也被认为是“提供了蛋白质与腐殖酸作用机制的直接证据”^{[ 11]}。受该项目资助所取得的成果,在国内外的土壤腐殖酸与酶相互作用领域产生广泛影响,引导了该领域在国际上的发展^{[ 11, 12]}；同时,丰富和完善了土壤化学理论,对深入认识土壤软胶体物质的界面过程和循环有重要意义。由于土壤是一个多界面的异质体系,酶在不同界面的分子机制与分子模拟及其不同尺度下的环境效应值得深入研究；现有研究工作主要关注于静态条件下腐殖酸与酶的作用机理与过程,但在自然环境中它们是一个动态过程,腐殖酸如何影响酶、微生物等软胶体物质在土壤剖面或地球关键带(Earth’s Critical Zone)中的迁移、转化,值得深入研究。